Biosens & Bioelectron：基于球形核酸級聯(lián)信號放大策略的高靈敏外泌體檢測方法

　　大量研究證實(shí)，腫瘤細胞衍生的外泌體參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉移過(guò)程，能夠反映相關(guān)癌癥信息。由于外泌體檢測在體液中分布廣泛，取樣過(guò)程創(chuàng )面小，因此被作為一種可靠的非入侵式生物標志物用于腫瘤的診斷和療效評估。傳統的外泌體檢測分析方法，如ELISA，western blotting，以及納米示蹤技術(shù)（nanoparticle tracking analysis，NTA），存在著(zhù)樣品需求量大、制備過(guò)程耗時(shí)以及靈敏度低等缺點(diǎn)。為克服這些不足，許多技術(shù)如表面等離子共振（SPR），表面增強拉曼散射（SERS）、流式細胞術(shù)、微流控等被發(fā)展出來(lái)用于提高外泌體檢測的靈敏度。然而，這些技術(shù)往往需要借助較為昂貴的儀器設備和復雜的表面修飾過(guò)程，不利于外泌體的高通量分析需求。因此，發(fā)展更易操作且靈敏度更高的方法用于外泌體的檢測分析具有重要的實(shí)際意義。

　　近期，南京大學(xué)生科院李根喜教授課題組與南京醫科大學(xué)第二附屬醫院腫瘤中心主任王朝霞教授課題組合作，通過(guò)在外泌體上設計球形核酸，提出了一種新的級聯(lián)信號擴增策略用于高靈敏外泌體檢測。相關(guān)成果以Spherical nucleic acids-based cascade signal amplification forhighly sensitive detection of exosomes為題發(fā)表在國際著(zhù)名學(xué)術(shù)期刊Biosensorsand Bioelectronics(2021,1;191:113465)上，博士研究生王磊為論文第一作者，李根喜教授和王朝霞教授為論文共同通訊作者。研究工作得到了國家自然科學(xué)基金以及南京大學(xué)優(yōu)秀博士研究生計劃項目的資助。

　　球形核酸（spherical nucleic acids，SNAs）是一種以球形納米材料為支點(diǎn)而修飾的一層致密且高度定向的核酸，其空間定性特性使得球形核酸和配體具有更高的親和力。合成球形核酸的材料通常有金屬納米顆粒、配位聚合物材料、微粒體和脂質(zhì)體等。與脂質(zhì)體類(lèi)似，外泌體也是一層由脂質(zhì)雙層膜包裹的囊泡結構且能夠進(jìn)行膜表面修飾。由于磷脂雙分子層膜的疏水性，膽固醇分子能夠通過(guò)疏水作用力簡(jiǎn)單快速地與生物膜結合�；�于此，研究人員設計將外泌體作為一個(gè)核心模板結合膽固醇修飾的DNA以形成球形核酸，并以此用于外泌體的檢測分析。

圖1：基于球形核酸的級聯(lián)信號放大策略用于電化學(xué)檢測外泌體的示意圖

　　如圖1所示，研究人員首先通過(guò)磁珠上修飾的適配體特異性捕獲外泌體。接著(zhù)，5’端修飾膽固醇的核酸引物鏈基于疏水作用力與外泌體膜結合，并以此形成以外泌體為核心的球形核酸。該球形核酸的3’端自由基能夠被脫氧核糖末端轉移酶（TdT）識別并延伸成polyT長(cháng)鏈。磁分離后，含有polyA的探針A能夠與polyT互補配對，并在核酸外切酶III（ExoIII）作用下切割探針A，形成短鏈核酸。該短鏈核酸又能被TdT延伸以及作為模板切割探針A。本設計中的探針A的5’端修飾亞甲基藍分子用于產(chǎn)生電信號輸出，3’端修飾雙脫氧胞嘧啶用于防止探針A被TdT延長(cháng)。當體系中的探針A被大量切割后，結合到電極上的電信號分子則很少，最終產(chǎn)生很低的電化學(xué)信號。反之，當體系中沒(méi)有目標外泌體時(shí)，以上反應便不能發(fā)生，即會(huì )產(chǎn)生很高的電信號輸出。

　　在該方法設計中有三重信號放大：1）一個(gè)外泌體上能夠結合許多引物鏈形成球形核酸；2）一條引物鏈被TdT酶延長(cháng)所形成的模板切割大量的探針A；3）被切割后形成的探針A短鏈作為新的引物循環(huán)第二重信號放大過(guò)程。因此，整個(gè)檢測過(guò)程無(wú)需復雜的核酸序列設計，便可獲得對外泌體的高靈敏檢測。此外，分析比較外泌體上EpCAM膜蛋白含量能夠區分不同腫瘤細胞外泌體。實(shí)驗中設計的特異性識別過(guò)程和簡(jiǎn)易的磁珠分離操作能在復雜的生物樣品中展現較好的分析性能。通過(guò)分析臨床實(shí)際樣本中的外泌體，該方法能夠區分惡性結直腸癌患者和健康對照，為其應用于癌癥診斷提供了可能。

　　李根喜教授課題組長(cháng)期從事生物分子工程及臨床檢驗應用方面的研究工作，在基于生物傳感的分子診斷技術(shù)研究方面取得了系列研究成果，近幾年針對外泌體分析新方法研究開(kāi)展了一些工作，如基于外泌體膜上的磷酸結構與鋯的配位作用（Chem.Commun.,2019,55:2708-2711；Anal.Chem.,2020,92:3819-3826），借助外泌體納米結構的空間位阻效應（ACS Appl.Mater.Interfaces,2020,12:322-329；Chem.Commun.,2020,56:13768-13771），通過(guò)酶信號擴增（Chem.Commun.,2021,57:8508-8511），或者使用共價(jià)有機框架材料（Biosensors and Bioelectronics,2020,169:112638）以及pH試紙（Talanta,2019,192:325-33）等嘗試了多種外泌體分析檢測新方法。鑒于該課題組在這些方面開(kāi)展了一些研究工作，Frontiers of Medicine邀請該課題組以Biosensor-basedassay of exosome biomarker for early diagnosis of cancer為題撰寫(xiě)了綜述，該文章已在線(xiàn)發(fā)表(https://doi.org/10.1007/s11684-021-0884-z)，并且出版社和期刊社已授權開(kāi)放獲取。